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    大鼠实验性结肠炎IL1β 和IL10的表达及银杏天宝对其影响


    我要投稿 作者:中国银杏网 出处:中国银杏网 时间:2013/8/15  类别:银杏叶片的作用 人气:1681

      作者:罗丽丹,周燕红,罗德生,刘琴

      【摘要】  目的 观察大鼠实验性结肠炎白细胞介素1β和白细胞介素-10的表达及银杏天宝(EGB)对其影响。方法利用三硝基苯磺酸灌肠制备大鼠实验性结肠炎模型。实验设正常对照组,三硝基苯磺酸模型组,5氨基水杨酸组(5ASA,100 mg/kg),EGB组(200mg/kg)。 4周后,评价结肠大体形态和组织学评分,检测MPO和SOD活性,免疫组化和ELISA检测肠组织IL1β和IL10表达。结果 与正常对照组比较,三硝基苯磺酸模型组大鼠结肠组织大体形态和组织学评分显着增加,MPO活性、肠组织IL-1β蛋白表达水平显着升高;SOD活性、肠组织IL10产生明显减少。EGB能改善三硝基苯磺酸模型组大鼠结肠组织大体形态和组织学损害,使MPO活性显着下降,同时下调IL1β蛋白表达水平,升高SOD活性,增加IL10的产生。结论 EGB通过下调肠组织IL1β 表达,上调IL10的产生发挥抗炎的作用,从而减轻大鼠实验性结肠炎的炎症损伤。

      【关键词】 银杏天宝 溃疡性结肠炎 白细胞介素 1β 白细胞介素 10

      Abstract:ObjectiveTo observe the expressions of IL1β and IL10 in TNBS-induced colitis in rats and the effects of Ginkgo biloba extract (EGB).MethodsThe colitis model of rats was established by intracolon enema with 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS,150 mg/kg). Rats were divided into 4 groups: normal group, model group, 5ASA group (100 mg/kg) and EGB group(200 mg/kg).The macroscopical and histological changes of the colon were evaluated. The activity of superoxide dismutase(SOD) and myeloperoxidasea (MPO) in the colonic mucosa were determined, respectively. The expressions of interleukin-1β(IL1β) and IL10 in the colon tissues of colitis rats were detected by immunohistochemistry and ELISA method.ResultsThe macroscopic and histological damage scores, the activity of MPO and the protn expressions of IL1β were markedly higher in model group than that in normal group. SOD activity and the IL10 production of colon tissue in model group were significantly lower than those in normal group. Treatment of EGB improved colonic macroscopical and histological damage score, enhanced colon tissue SOD activities, increased colon IL10 production, and decreased colon IL1β expression and colon tissue MPO activities. ConclusionThe treatment of EGB was effective for relieving and repairing colonic inflammation and the effects were related to stimulation of IL10 production and down-regulation of IL1β expression in TNBSinduced colitis.

      Key words:Ginkgo biloba extract; Ulcerative colitis; Interleukin1β; Interleukin10

      溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)在我国发病率呈逐年上升的趋势,因其为一类病因尚未完全明确的肠道非特异性炎症,目前无特异性的 治疗 措施。免疫因素在UC发病中的作用越来越受到人们重视,异常的免疫反应或正常免疫调节的破坏是UC发病的重要环节。免疫功能紊乱后,必然导致细胞因子 失衡,造成恶性循环,白介素(interleukin, IL)作为最重要的细胞因子,在溃疡性结肠炎的发病中占据了重要的地位。银杏天宝(EGB)国内外已广泛于治疗心、脑血管疾病[1,2],但其防治UC的作用机制尚未十分明确。本实验通过观察大鼠实验性结肠炎致炎性细胞因子白细胞介素1β(IL1β)和抗炎性细胞因子白细胞介素10(IL10)的表达及银杏天宝对其影响,以探讨银杏天宝治疗UC机制、为银杏天宝治疗UC提供理论依据。

      1 材料和方法

      1.1 材料

      雄性SD大鼠40只(180±20)g,购于湖北省实验动物中心。2,4,6三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)购自Sigma公司。银杏宝(Ginkgo biloba extract,EGB)为贵州信邦制药股份有限公司提供(No.501420)。5氨基水杨酸(5aminosalicylic acid,5-ASA)由国怡药业有限公司提供(No.0209477)。IL1β多克隆抗体购自Santa Cruz公司。大鼠IL10ELISA检测试剂盒购于Biosource公司。髓过氧化酶(myeloperoxidase activity, MPO)、超氧化物岐化酶(Superoxide clismutase ,SOD)试剂盒购自南京建成生物研究所。

      1.2 方法

      1.2.1 模型的建立及分组

      大鼠正常喂养,随机分为正常对照组、三硝基苯磺酸模型组、阳性药物对照组(5-ASA组,100 mg/kg)、EGB组(200 mg/kg)4组,每组10只。按照 文献 [3]将TNBS溶于500 ml/L乙醇至终浓度150 mg/kg,建立大鼠实验性结肠炎模型,正常对照组以50%乙醇代替TNBS灌肠。正常对照组及模型组给予生理盐水灌胃,5ASA组和EGB组分别给予5ASA 100 mg/kg,EGB 200 mg/kg灌胃, 从造模后第2天至实验结束每天灌胃给药1次/d,共4周。4 周后大鼠经水合氯醛麻醉后取出全结肠,纵向剪开,冲洗掉污物,在病变严重处剪取肠组织,参照文献[3]肉眼观察大体形态并进行评分。另取病变最明显处组织甲醛固定,石蜡包埋、切片、HE染色,参照文献标准[3,4]光镜下观察病理组织学变化。

      1.2.2 肠组织MPO和SOD检测

      取适量结肠新鲜标本,快速置于液氮中速冻,供检测MPO和SOD,检测按试剂盒说明书要求操作。

      1.2.3 肠组织IL-10浓度的测定

      按4 ml/g组织的比例加人生理盐水,匀浆,匀浆液3 000 r/min离心10 min后吸取上清,采用ELISA法测定肠组织IL10浓度,按试剂盒说明进行。

      1.2.4 免疫组化检测肠组织IL-1β表达

      操作按照SP 免疫组化染色试剂说明书进行。一抗稀释浓度为IL1β( 1∶100)。以PBS 代替一抗,作为阴性对照。结果判断:细胞呈棕黄色为阳性。IL1β表达于胞浆,每张切片 计算 任意10个高倍视野(200×)中阳性细胞所占的百分比例。

      2 结果

      2.1 结肠大体形态和组织学评分大体观察,三硝基苯磺酸模型组肉眼观察到病变主要在近肛门段结肠,可见结肠黏膜充血水肿、糜烂、溃疡形成。EGB组及 5ASA组显着改善UC大鼠结肠大体形态评分(P 0.01)。见表1。

      表1 EGB对大鼠实验性结肠炎肠组织大体形态、组织学评分和MPO活性的影响(略)

      学损伤评分:光镜下见正常对照组黏膜上皮完整,无组织损伤及炎症细胞浸润,固有层腺体排列密集。三硝基苯磺酸模型组黏膜上皮坏死脱落,形成溃疡并深入到固有层,溃疡面及固有层有大量炎性细胞浸润,腺体结构破坏。EGB组和5ASA组可见黏膜损伤基本愈合,腺体结构基本恢复正常(P0.01)。见表1。

      2.2 肠组织MPO和SOD测定结果

      与正常对照组相比,三硝基苯磺酸模型组肠组织MPO活性明显增高,SOD活性明显减少(P0.01)。EGB组和5ASA组肠组织MPO活性较模型组低,SOD活性较模型组高,差异有显着性( P0.01)。见表1,2。表2 EGB对大鼠实验性结肠炎肠组织SOD活性和IL1β,IL10表达的影响(略)

      2.3 肠组织IL10浓度测定结果

      三硝基苯磺酸模型组肠组织IL10浓度较正常对照组明显减少,差异有显着性(P0.01)。 EGB组和5ASA组IL10浓度较模型组高,差异有显着性( P0.01)。见表2。

      2.4 IL1β免疫组化染色结果与正常对照组相比,模型组大鼠肠组织可见大量IL1β阳性细胞,呈棕黄色颗粒,胞浆着色,主要分布在黏膜及黏膜下层,差异有显着性( P0.01)。经过EGB 治疗 后,与模型对照组比较IL1β表达显着降低(P0.01),而EGB组与5ASA组比较IL1β表达没有显着性差异(P0 .05)。见表2,1。

      3 讨论

      IL1β为介导UC发病的致炎性细胞因子之一,具有多种生物学效应,能通过自分泌或旁分泌刺激其他细胞因子和炎症介质IL2,IL6,IL8,TNFα等的产生,并相互影响,导致UC发生。可促进B细胞的增殖、分化、介导免疫球蛋白的分泌,激活补体,杀伤细胞及吞噬细胞的活性,增强细胞免疫和体液免疫介导肠组织的损伤。 此外,IL1β可产生对中性粒细胞等炎症细胞的趋化作用,吸引其进入肠道病变部位,引起一系列肠道炎症反应和组织破坏,最终造成UC的发病。动物实验和研究均证实IL1β的升高与UC的发生 密切相关[5,6]。

      IL10又名细胞因子合成抑制因子,主要由Th2细胞分泌,是一种抗炎性细胞因子,有免疫调节和抗炎性作用,在肠道免疫中起关键作用。人IL10能下调树突状细胞分泌IL12,能下调活化的单核细胞和巨噬细胞转录分泌IL1β,IL6,IL8,TNFα和GCSF。IL10基因剔除的小鼠可发生结肠炎,给予IL10可预防其发生,说明IL10在维持正常肠道黏膜免疫调节中发挥重要作用。Schrber等[7]研究表明IL10能影响UC病人IL1ra/IL1β的比例,发现IL10能使IBD患者己下降的IL1ra/IL-1比值恢复正常。用IL10灌肠治疗UC病人,能明显改善肠道黏膜炎症。

      银杏天宝作为一种天然抗氧化剂,主要活性成分为24%黄酮糖苷和6%萜内酯。其分子中含有还原性羟基功能基团,可直接清除O2-,OH-,脂质过氧化自由基等,可阻止和抑制氧自由基反应和脂质过氧化反应。能改善微循环,抗炎,调整免疫系统等[8]。本课题组前期研究表明EGB可通过抑制IL12,IFNγ生成,恢复Th1/Th2细胞因子的平衡,发挥对溃疡性结肠炎的保护作用[9]。

      本研究表明TNBS诱导的实验性结肠炎大鼠大体形态和组织学评分明显升高,MPO活性明显升高。MPO主要存在于炎症细胞,尤其是中性粒细胞的细胞质中,其活性反映了组织中炎症细胞的浸润程度,即炎症的活动程度,被认作是量化UC炎症的一项重要指标。SOD是机体主要抗氧化酶,其活力反映机体清除氧自由基的能力。模型组大鼠SOD活性明显减少。在溃疡性结肠炎肠黏膜组织中IL1β表达明显增高,IL10明显减少,可能与实验性结肠炎的炎症损伤相关。EGB能明显减少实验性结肠炎大鼠MPO活性,增加SOD活性,减少IL1β 表达,上调IL10的浓度发挥抗氧化和抗炎的作用来减少大鼠实验性结肠炎的炎症损伤。

      【 参考 文献 】

      [1]Maitra I, Marcocci L, Droy-Lefaix MT, et al. Peroxyl radical scavenging activity of Ginkgo biloba extract EGb 761[J].Biochem Pharmacol, 1995, 49(11):1649.

      [2]Kusmic C, Basta G, Lazzerini G,et al.The effect of Ginkgo biloba in isolated ischemic/reperfused rat heart: a link between vitamin E preservation and prostaglandin biosynthesis[J].J Cardiovasc Pharmacol, 2004,44(3):356.

      [3]Morris GP, Beck PL, Herridge MS,et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology, 1989,96:795.

      [4]M Q, Yu JP, Xu JM, et al.Melatonin reduces colon immunological injury in rats by regulating activity of macrophages[J].Acta Pharmacol Sin ,2002,23: 882.

      [5]Wu HG, Liu HR, Zhao C, et al. Study on differentially expressed genes of ulcerative colitis in the rat treated by herbs-partitioned moxibustion[J].Zhongguo Zhenjiu ,2005,25:359.

      [6]Sawa Y, Oshitani N, Adachi K, et al.Comprehensive analysis of intestinal cytokine messenger RNA profile by real-time quantitative polymerase chain reaction in patients with Inflammatory bowel disease[J].Int J Mol Med,2003,11:175.

      [7]Schreiber S, Heinig T, Thiele HG, et al. Immunoregulatory role of interleukin 10 in patients with inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology,1995,108(5):1434.

      [8]Sakarcan A, Sehirli O, Velioglu-Ovunc A et al.Ginkgo biloba extract improves oxidative organ damage in a rat model of thermal trauma[J]. J Burn Care Rehabil,2005,26(6):515.

      [9]周燕红,于皆平,何小飞,等. 达纳康对大鼠溃疡性结肠炎细胞因子的影响[J].世界华人消化杂志,2004,12(2):371.

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